mRNA-Seq入門【第三回】

mRNA-Seq 解析の流れをざっくりと説明してみた mRNA-Seq 解析 マッピング編 2021/12/02 ⽔産⽣物環境学（九州⼤学） ⾼井優⽣

今回はマッピング編ですが どんな解析ツールを使うとしても

マニュアルを しっかりと 読んでください

これが⼀番基本です 「できなーい」と⾔ってる⼈の 99.999% は マニュアルを読んでません

「読んだし︕」と⾔い張る⼈もいますが 読んでません それは ⾒ただけです

もう⼀度⾔います

マニュアルを しっかりと 読んでください

mRNA-Seq 解析の流れをざっくりと説明してみた mRNA-Seq 解析 マッピング編 2021/12/02 ⽔産⽣物環境学（九州⼤学） ⾼井優⽣

インデックス作成 STAR

マッピング⽤のインデックス作成 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 最初 だけ マッピングをする時に STAR が使⽤する⽬印（索引、インデックス）を作ってあげるイメージです 使うオプションはこんな感じです（詳細はマニュアルを読んでください） オプション 指定する内容の⼤まかな説明 --runMode 実⾏する処理の内容を指定 --genomeFastaFiles ゲノム配列のファイルの場所（ファイル名） --genomeDir インデックスを保存する場所（ディレクトリ） --sjdbGTFfile GTFファイルの場所（ファイル名） --sjdbOverhang マニュアル参照、リードの⻑さ – 1 の値を⼊れると良いらしい --runThreadN 使⽤するスレッド数 実際にはこんな感じ ubuntu@ubuntu-man$ STAR --runMode genomeGenerate \ > --genomeFastaFiles /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa \ > --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka \ > --sjdbGTFfile /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf \ > --sjdbOverhang 149 \ > --runThreadN 8

マッピング⽤のインデックス作成 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 最初 だけ うまくいくとこんな感じの出⼒になります ubuntu@ubuntu-man$ STAR --runMode genomeGenerate \ > --genomeFastaFiles /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa \ > --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka \ > --sjdbGTFfile /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf \ > --sjdbOverhang 149 \ > --runThreadN 8 STAR --runMode genomeGenerate --genomeFastaFiles /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka --sjdbGTFfile /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf --sjdbOverhang 149 --runThreadN 8 -STAR version: 2.7.9a compiled: 2021-08-24T11:30:05+09:00 :/home/ubuntu/src/STAR-2.7.9a/source Nov 30 09:13:29 ..... started STAR run Nov 30 09:13:29 ... starting to generate Genome files Nov 30 09:13:53 ..... processing annotations GTF Nov 30 09:14:13 ... starting to sort Suffix Array. This may take a long time... Nov 30 09:14:22 ... sorting Suffix Array chunks and saving them to disk... Nov 30 09:20:44 ... loading chunks from disk, packing SA... Nov 30 09:21:21 ... finished generating suffix array Nov 30 09:21:21 ... generating Suffix Array index Nov 30 09:23:05 ... completed Suffix Array index Nov 30 09:23:06 ..... inserting junctions into the genome indices Nov 30 09:28:35 ... writing Genome to disk ... Nov 30 09:28:37 ... writing Suffix Array to disk ... Nov 30 09:28:46 ... writing SAindex to disk Nov 30 09:28:48 ..... finished successfully

マッピング⽤のインデックス作成 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 最初 だけ ubuntu@ubuntu-man$ STAR --runMode genomeGenerate \ > --genomeFastaFiles /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa \ > --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka \ > --sjdbGTFfile /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf \ > --sjdbOverhang 149 \ > --runThreadN 8 STAR --runMode genomeGenerate --genomeFastaFiles ゲノムのサイズによってはこういう警告が出てくる時もあります /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka --sjdbGTFfile !!!!! WARNING: --genomeSAindexNbases 14 is too large for the genome size=809679899, which may cause /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf --sjdbOverhang--genomeSAindexNbases 149 --runThreadN 8 -seg-fault at the mapping step. Re-run genome generation with recommended 13 STAR version: 2.7.9a compiled: 2021-08-24T11:30:05+09:00 :/home/ubuntu/src/STAR-2.7.9a/source Nov 30 09:13:29 ..... started STAR run これを無視するとあとで⼤変なこと（マッピングできなくなります）になるので Nov 30 09:13:29 ... starting to generate Genome files 素直にメッセージに従ってあげましょう Nov 30 09:13:53 ..... processing annotations GTF Nov 30 09:14:13 ... starting to sort Suffix Array. This may take a long time... Nov 30 09:14:22 ... sorting Suffix Array chunks and saving them to disk... Nov 30 09:20:44 ... loading chunks from disk, packing SA... Nov 30 09:21:21 ... finished generating suffix array Nov 30 09:21:21 ... generating Suffix Array index Nov 30 09:23:05 ... completed Suffix Array index Nov 30 09:23:06 ..... inserting junctions into the genome indices Nov 30 09:28:35 ... writing Genome to disk ... Nov 30 09:28:37 ... writing Suffix Array to disk ... Nov 30 09:28:46 ... writing SAindex to disk Nov 30 09:28:48 ..... finished successfully

マッピング⽤のインデックス作成 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 最初 だけ ubuntu@ubuntu-man$ STAR --runMode genomeGenerate \ > --genomeFastaFiles /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa \ > --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka \ > --sjdbGTFfile /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf \ > --sjdbOverhang 149 \ > --runThreadN 8 STAR --runMode genomeGenerate --genomeFastaFiles ゲノムのサイズによってはこういう警告が出てくる時もあります /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka --sjdbGTFfile !!!!! WARNING: --genomeSAindexNbases 14 is too large for the genome size=809679899, which may cause /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf --sjdbOverhang--genomeSAindexNbases 149 --runThreadN 8 -seg-fault at the mapping step. Re-run genome generation with recommended 13 STAR version: 2.7.9a compiled: 2021-08-24T11:30:05+09:00 :/home/ubuntu/src/STAR-2.7.9a/source Nov 30 09:13:29 ..... started STAR run これを無視するとあとで⼤変なこと（マッピングできなくなります）になるので Nov 30 09:13:29 ... starting to generate Genome files 素直にメッセージに従ってあげましょう Nov 30 09:13:53 ..... processing annotations GTF これでもう⼀回実⾏ Nov 30 09:14:13 ... starting to sort Suffix Array. This may take a long time... Nov 30 09:14:22 ... sorting Suffix Array chunks and saving them to disk... ubuntu@ubuntu-man$ STAR --runMode \ Nov 30 09:20:44 ... loading chunks from genomeGenerate disk, packing SA... > /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa \ Nov--genomeFastaFiles 30 09:21:21 ... finished generating suffix array Nov--genomeDir 30 09:21:21 ... generating Suffix Array index > /home/ubuntu/references/java_medaka \ Nov 30 09:23:05 ... completed Suffix Array index > --sjdbGTFfile /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf \ Nov 30 09:23:06 ..... inserting junctions into the genome indices > \ Genome to disk ... Nov--sjdbOverhang 30 09:28:35 ... 149 writing > 8 \writing Suffix Array to disk ... Nov--runThreadN 30 09:28:37 ... > 13 Nov--30genomeSAindexNbases 09:28:46 ... writing SAindex to disk Nov 30 09:28:48 ..... finished successfully

マッピング⽤のインデックス作成 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 最初 だけ インデックス作成は⼀つのゲノム配列につき⼀回⾏えば良いので マッピングの度にインデックス作成をやり直す必要はありません ubuntu@ubuntu-man$ STAR --runMode genomeGenerate \ > --genomeFastaFiles /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa \ > --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka \ > --sjdbGTFfile /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf \ > --sjdbOverhang 149 \ > --runThreadN 8 STAR --runMode genomeGenerate --genomeFastaFiles ゲノムのサイズによってはこういう警告が出てくる時もあります /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka --sjdbGTFfile !!!!! WARNING: --genomeSAindexNbases 14 is too large for the genome size=809679899, which may cause /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf --sjdbOverhang--genomeSAindexNbases 149 --runThreadN 8 -seg-fault at the mapping step. Re-run genome generation with recommended 13 STAR version: 2.7.9a compiled: 2021-08-24T11:30:05+09:00 :/home/ubuntu/src/STAR-2.7.9a/source Nov 30 09:13:29 ..... started STAR run これを無視するとあとで⼤変なこと（マッピングできなくなります）になるので Nov 30 09:13:29 ... starting to generate Genome files 素直にメッセージに従ってあげましょう Nov 30 09:13:53 ..... processing annotations GTF これでもう⼀回実⾏ Nov 30 09:14:13 ... starting to sort Suffix Array. This may take a long time... Nov 30 09:14:22 ... sorting Suffix Array chunks and saving them to disk... ubuntu@ubuntu-man$ STAR --runMode \ Nov 30 09:20:44 ... loading chunks from genomeGenerate disk, packing SA... > /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.dna.toplevel.fa \ Nov--genomeFastaFiles 30 09:21:21 ... finished generating suffix array Nov--genomeDir 30 09:21:21 ... generating Suffix Array index > /home/ubuntu/references/java_medaka \ Nov 30 09:23:05 ... completed Suffix Array index > --sjdbGTFfile /home/ubuntu/references/java_medaka/Oryzias_javanicus.OJAV_1.1.104.gtf \ Nov 30 09:23:06 ..... inserting junctions into the genome indices > \ Genome to disk ... Nov--sjdbOverhang 30 09:28:35 ... 149 writing > 8 \writing Suffix Array to disk ... Nov--runThreadN 30 09:28:37 ... > 13 Nov--30genomeSAindexNbases 09:28:46 ... writing SAindex to disk Nov 30 09:28:48 ..... finished successfully

マッピング STAR

ゲノム配列へのマッピング 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 作成したインデックスを使⽤して、mRNA-Seq のリードをゲノム配列にマッピングしていきます オプション 指定する内容の⼤まかな説明 --genomeDir インデックスを保存した場所（ディレクトリ） --readFilesIn リードファイルの場所（ファイル名） --readFilesCommand リードデータの解凍コマンド（リードファイルが gz などで圧縮されてる場合のみ） --outFileNamePrefix 出⼒結果の名前 --outSAMtype 出⼒ファイルの種類（ソートした BAM ファイルがおすすめ） --quantMode マッピングしたリードのカウントを⾏う（遺伝⼦単位、トランスクリプト単位） --runThreadN 使⽤するスレッド数 ubuntu@ubuntu-man$ STAR --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka \ > --readFilesIn /home/ubuntu/takai/00_Java_ANTandMP/00_CleanReads/C1_1.fq.gz \ > /home/ubuntu/takai/00_Java_ANTandMP/00_CleanReads/C1_2.fq.gz \ > --readFilesCommand gunzip -c \ > --outFileNamePrefix /home/ubuntu/takai/00_Java_ANTandMP/02_STAR/C1_ \ > --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \ > --quantMode GeneCounts \ > --runThreadN 8

ゲノム配列へのマッピング 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） うまくいくとこんな感じの出⼒になります ubuntu@ubuntu-man$ STAR --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka \ > --readFilesIn /home/ubuntu/takai/00_Java_ANTandMP/00_CleanReads/C1_1.fq.gz \ > /home/ubuntu/takai/00_Java_ANTandMP/00_CleanReads/C1_2.fq.gz \ > --readFilesCommand gunzip -c \ > --outFileNamePrefix /home/ubuntu/takai/00_Java_ANTandMP/02_STAR/C1_ \ > --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \ > --quantMode GeneCounts \ > --runThreadN 8 STAR --genomeDir /home/ubuntu/references/java_medaka --readFilesIn /home/ubuntu/takai/00_Java_ANTandMP/00_CleanReads/C1_1.fq.gz /home/ubuntu/takai/00_Java_ANTandMP/00_CleanReads/C1_2.fq.gz --readFilesCommand gunzip -c --outFileNamePrefix /home/ubuntu/takai/00_Java_ANTandMP/02_STAR/C1_ --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --quantMode GeneCounts -runThreadN 8 STAR version: 2.7.9a compiled: 2021-08-24T11:30:05+09:00 :/home/ubuntu/src/STAR-2.7.9a/source Nov 30 12:08:05 ..... started STAR run Nov 30 12:08:05 ..... loading genome Nov 30 12:08:14 ..... started mapping Nov 30 12:20:15 ..... finished mapping Nov 30 12:20:18 ..... started sorting BAM Nov 30 12:20:45 ..... finished successfully

マッピング結果の確認 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） --outFileNamePrefix で指定したディレクトリに以下のファイルができます ファイル名 ファイルの中⾝ <Prefix>_Aligned.sortedByCoord.out.bam 【重要】どのリードがゲノムのどの場所にマッピング されたかを⽰す情報（IGV でマッピング結果 を可視化するときに使う） <Prefix>_Log.final.out 【重要】最終的なマッピング結果の統計量 <Prefix>_Log.out マッピングのログ <Prefix>_Log.progress.out マッピングしてるときのログ <Prefix>_ReadsPerGene.out.tab 【重要】遺伝⼦ごとにマッピングしたリードを カウントした結果 <Prefix>_SJ.out.tab スプライスジャンクションに関する情報

マッピング結果の確認 ubuntu@ubuntu-man$ cat C1_Log.final.out Started job on Started mapping on Finished on Mapping speed, Million of reads per hour 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） | | | | Nov 30 12:08:05 Nov 30 12:08:14 Nov 30 12:20:45 52.64 Number of input reads | 10981870 --outFileNamePrefix で指定したディレクトリに以下のファイルができます ファイル名 Average input read length | UNIQUE READS: Uniquely mapped reads number | Uniquely mapped reads % | Average mapped length | Number of splices: Total | Number of splices: Annotated (sjdb) | Number of splices: GT/AG | Number of splices: GC/AG | Number of splices: AT/AC | Number of splices: Non-canonical | Mismatch rate per base, % | Deletion rate per base | Deletion average length | Insertion rate per base | Insertion average length | MULTI-MAPPING READS: Number of reads mapped to multiple loci | % of reads mapped to multiple loci | Number of reads mapped to too many loci | % of reads mapped to too many loci | UNMAPPED READS: Number of reads unmapped: too many mismatches | % of reads unmapped: too many mismatches | Number of reads unmapped: too short | % of reads unmapped: too short | Number of reads unmapped: other | % of reads unmapped: other | CHIMERIC READS: Number of chimeric reads | % of chimeric reads | ファイルの中⾝ 295 9938499 90.50% 293.11 13872226 13152511 13787197 61166 1620 22243 0.52% 0.03% 2.60 0.03% 2.03 <Prefix>_Aligned.sortedByCoord.out.bam 【重要】どのリードがゲノムのどの場所にマッピング されたかを⽰す情報（IGV でマッピング結果 を可視化するときに使う） <Prefix>_Log.final.out 【重要】最終的なマッピング結果の統計量 <Prefix>_Log.out <Prefix>_Log.progress.out マッピングのログ マッピングしてるときのログ <Prefix>_ReadsPerGene.out.tab 【重要】遺伝⼦ごとにマッピングしたリードを 314950 カウントした結果 2.87% <Prefix>_SJ.out.tab スプライスジャンクションに関する情報 0.35% 37969 0 0.00% 607775 5.53% 82677 0.75% 0 0.00%

マッピング結果の確認 ubuntu@ubuntu-man$ cat C1_Log.final.out Started job on Started mapping on Finished on Mapping speed, Million of reads per hour 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） | | | | Nov 30 12:08:05 Nov 30 12:08:14 Nov 30 12:20:45 52.64 Number of input reads | 10981870 --outFileNamePrefix で指定したディレクトリに以下のファイルができます ファイル名 Average input read length | UNIQUE READS: Uniquely mapped reads number | Uniquely mapped reads % | Average mapped length | Number of splices: Total | Number of splices: Annotated (sjdb) | Number of splices: GT/AG | Number of splices: GC/AG | Number of splices: AT/AC | Number of splices: Non-canonical | Mismatch rate per base, % | Deletion rate per base | Deletion average length | Insertion rate per base | Insertion average length | MULTI-MAPPING READS: Number of reads mapped to multiple loci | % of reads mapped to multiple loci | Number of reads mapped to too many loci | % of reads mapped to too many loci | UNMAPPED READS: Number of reads unmapped: too many mismatches | % of reads unmapped: too many mismatches | Number of reads unmapped: too short | % of reads unmapped: too short | Number of reads unmapped: other | % of reads unmapped: other | CHIMERIC READS: Number of chimeric reads | % of chimeric reads | ファイルの中⾝ 295 9938499 90.50% 293.11 ゲノム配列がしっかりしてると 13872226 13152511 だいたいどの⽣物でもこれくらい 13787197 （80%後半以上） 61166 1620 22243 0.52% 0.03% 2.60 0.03% 2.03 <Prefix>_Aligned.sortedByCoord.out.bam 【重要】どのリードがゲノムのどの場所にマッピング されたかを⽰す情報（IGV でマッピング結果 を可視化するときに使う） <Prefix>_Log.final.out 【重要】最終的なマッピング結果の統計量 <Prefix>_Log.out <Prefix>_Log.progress.out マッピングのログ マッピングしてるときのログ <Prefix>_ReadsPerGene.out.tab 【重要】遺伝⼦ごとにマッピングしたリードを 314950 カウントした結果 2.87% <Prefix>_SJ.out.tab スプライスジャンクションに関する情報 0.35% 37969 0 0.00% 607775 5.53% 82677 0.75% 0 0.00%

マッピング結果の確認 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） --outFileNamePrefix で指定したディレクトリに以下のファイルができます 左から ファイル名 ・遺伝⼦ ID ファイルの中⾝ ・ストランド⾮特異的 mRNA-Seq のカウント 【重要】どのリードがゲノムのどの場所にマッピング <Prefix>_Aligned.sortedByCoord.out.bam ・ストランド特異的 mRNA-Seq のカウント（1st read strand） されたかを⽰す情報（IGV でマッピング結果 を可視化するときに使う） ・ストランド特異的 mRNA-Seq のカウント（2nd read strand） <Prefix>_Log.final.out <Prefix>_Log.out <Prefix>_Log.progress.out <Prefix>_ReadsPerGene.out.tab <Prefix>_SJ.out.tab 【重要】最終的なマッピング結果の統計量 ubuntu@ubuntu-man$ head C1_ReadsPerGene.out.tab N_unmapped 728530 728530 728530 N_multimapping 314950 314950 314950 N_noFeature 770179 5286332 5307589 N_ambiguous 206784 45629 48143 ENSOJAG00000000068 0 0 0 ENSOJAG00000000073 2 2 0 ENSOJAG00000000082 0 0 0 ENSOJAG00000000089 0 0 0 ENSOJAG00000000092 2 2 0 ENSOJAG00000000110 0 0 0 マッピングのログ マッピングしてるときのログ 【重要】遺伝⼦ごとにマッピングしたリードを カウントした結果 スプライスジャンクションに関する情報 今回の mRNA-Seq はストランド⾮特異的なので この列のカウントデータを使って発現量解析をする というわけで、全サンプルのマッピングを For ⽂でぶん回してください

For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂ For⽂

発現量解析⽤ カウントデータの作成 STAR

発現量解析⽤カウントデータの作成 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 全サンプルのマッピングが終わったら cut とリダイレクション、paste を使って発現量解析⽤のデータセット（カウントデータ）を作ります ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ : : cut cut cut cut –f –f –f –f 1 2 2 2 C1_ReadsPerGene.out.tab C1_ReadsPerGene.out.tab C2_ReadsPerGene.out.tab C3_ReadsPerGene.out.tab > > > > gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv ⼀⾏⽬︓STAR が吐き出したサンプル C1 のカウントデータから⼀列⽬（遺伝⼦ ID）を gene_ids.tsv（タブ 区切りファイル）というファイルに書き出す ⼆⾏⽬︓サンプル C1 のカウントデータを C1.tsv というファイルに書き出す 三⾏⽬︓サンプル C2 のカウントデータを C2.tsv というファイルに書き出す 四⾏⽬︓サンプル C3 のカウントデータを C3.tsv というファイルに書き出す

発現量解析⽤カウントデータの作成 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 全サンプルのマッピングが終わったら cut とリダイレクション、paste を使って発現量解析⽤のデータセット（カウントデータ）を作ります ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ : : cut cut cut cut –f –f –f –f 1 2 2 2 C1_ReadsPerGene.out.tab C1_ReadsPerGene.out.tab C2_ReadsPerGene.out.tab C3_ReadsPerGene.out.tab > > > > gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv ⼀⾏⽬︓STAR が吐き出したサンプル C1 のカウントデータから⼀列⽬（遺伝⼦ ID）を gene_ids.tsv（タブ 区切りファイル）というファイルに書き出す ⼆⾏⽬︓サンプル C1 のカウントデータを C1.tsv というファイルに書き出す 三⾏⽬︓サンプル C2 のカウントデータを C2.tsv というファイルに書き出す 四⾏⽬︓サンプル C3 のカウントデータを C3.tsv というファイルに書き出す ubuntu@ubuntu-man$ paste gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv > count.tsv ubuntu@ubuntu-man$ vi count_data.tsv ubuntu@ubuntu-man$ cat count.tsv >> count_data.tsv ⼀⾏⽬︓gene_ids.tsv と各サンプルのカウントデータを結合して count.tsv に書き出す ⼆⾏⽬︓サンプル名のファイルを作成する（上記の作業では各列のサンプル名が分からなくなるため） 三⾏⽬︓count.tsv を count_data.tsv に追記して解析⽤のデータセットを作成する

発現量解析⽤カウントデータの作成 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 全サンプルのマッピングが終わったら cut とリダイレクション、paste を使って発現量解析⽤のデータセット（カウントデータ）を作ります ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ : : cut cut cut cut –f –f –f –f 1 C1_ReadsPerGene.out.tab > gene_ids.tsv 2 C1_ReadsPerGene.out.tab > C1.tsv の使い⽅はぐぐってもらうとして、、、 2 vi C2_ReadsPerGene.out.tab > C2.tsv 2 C3_ReadsPerGene.out.tab > C3.tsv サンプル名の順番を間違えないように gene_id C1 C2 C3 CP1 CP2 CP3 ⼀⾏⽬︓STAR が吐き出したサンプル C1 のカウントデータから⼀列⽬（遺伝⼦ ID）を gene_ids.tsv（タブ 区切りファイル）というファイルに書き出す ⼆⾏⽬︓サンプル C1 のカウントデータを C1.tsv というファイルに書き出す 三⾏⽬︓サンプル C2 のカウントデータを C2.tsv というファイルに書き出す ”count_data.tsv" [New File] 四⾏⽬︓サンプル C3 のカウントデータを C3.tsv というファイルに書き出す ubuntu@ubuntu-man$ paste gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv > count.tsv ubuntu@ubuntu-man$ vi count_data.tsv ubuntu@ubuntu-man$ cat count.tsv >> count_data.tsv ⼀⾏⽬︓gene_ids.tsv と各サンプルのカウントデータを結合して count.tsv に書き出す ⼆⾏⽬︓サンプル名のファイルを作成する（上記の作業では各列のサンプル名が分からなくなるため） 三⾏⽬︓count.tsv を count_data.tsv に追記して解析⽤のデータセットを作成する

発現量解析⽤カウントデータの作成 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） 全サンプルのマッピングが終わったら がちゃがちゃ書きましたが、もっと簡単な⽅法があります cut とリダイレクション、paste を使って発現量解析⽤のデータセット（カウントデータ）を作ります 宿＆題 ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ : : cut cut cut cut –f –f –f –f 1 2 2 2 C1_ReadsPerGene.out.tab C1_ReadsPerGene.out.tab C2_ReadsPerGene.out.tab C3_ReadsPerGene.out.tab > > > > gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv ⼀⾏⽬︓STAR が吐き出したサンプル C1 のカウントデータから⼀列⽬（遺伝⼦ ID）を gene_ids.tsv（タブ 区切りファイル）というファイルに書き出す ⼆⾏⽬︓サンプル C1 のカウントデータを C1.tsv というファイルに書き出す 三⾏⽬︓サンプル C2 のカウントデータを C2.tsv というファイルに書き出す 四⾏⽬︓サンプル C3 のカウントデータを C3.tsv というファイルに書き出す ubuntu@ubuntu-man$ paste gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv > count.tsv ubuntu@ubuntu-man$ vi count_data.tsv ubuntu@ubuntu-man$ cat count.tsv >> count_data.tsv 考えてみてください ⼀⾏⽬︓gene_ids.tsv と各サンプルのカウントデータを結合して count.tsv に書き出す ⼆⾏⽬︓サンプル名のファイルを作成する（上記の作業では各列のサンプル名が分からなくなるため） 三⾏⽬︓count.tsv を count_data.tsv に追記して解析⽤のデータセットを作成する

発現量解析⽤カウントデータの作成 答え 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） そんなに⼤きなデータじゃないので 全サンプルのマッピングが終わったら それぞれのカウントデータを⾃分のパソコンにもってきて cut とリダイレクション、paste を使って発現量解析⽤のデータセット（カウントデータ）を作ります エクセルで ぱっぱっぱと コピペ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ : : cut cut cut cut –f –f –f –f 1 2 2 2 C1_ReadsPerGene.out.tab C1_ReadsPerGene.out.tab C2_ReadsPerGene.out.tab C3_ReadsPerGene.out.tab > > > > gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv ⼀⾏⽬︓STAR が吐き出したサンプル C1 のカウントデータから⼀列⽬（遺伝⼦ ID）を gene_ids.tsv（タブ 区切りファイル）というファイルに書き出す ⼆⾏⽬︓サンプル C1 のカウントデータを C1.tsv というファイルに書き出す 三⾏⽬︓サンプル C2 のカウントデータを C2.tsv というファイルに書き出す 四⾏⽬︓サンプル C3 のカウントデータを C3.tsv というファイルに書き出す ubuntu@ubuntu-man$ paste gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv > count.tsv ubuntu@ubuntu-man$ vi count_data.tsv ubuntu@ubuntu-man$ cat count.tsv >> count_data.tsv ⼀⾏⽬︓gene_ids.tsv と各サンプルのカウントデータを結合して count.tsv に書き出す していけば良いですね ⼆⾏⽬︓サンプル名のファイルを作成する（上記の作業では各列のサンプル名が分からなくなるため） 三⾏⽬︓count.tsv を count_data.tsv に追記して解析⽤のデータセットを作成する

発現量解析⽤カウントデータの作成 答え 使⽤するソフトウェア︓STAR（2.7.9a） そんなに⼤きなデータじゃないので 全サンプルのマッピングが終わったら それぞれのカウントデータを⾃分のパソコンにもってきて cut とリダイレクション、paste を使って発現量解析⽤のデータセット（カウントデータ）を作ります エクセルで ぱっぱっぱと コピペ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ ubuntu@ubuntu-man$ : : cut cut cut cut –f –f –f –f 1 2 2 2 C1_ReadsPerGene.out.tab C1_ReadsPerGene.out.tab C2_ReadsPerGene.out.tab C3_ReadsPerGene.out.tab > > > > gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv ⼀⾏⽬︓STAR が吐き出したサンプル C1 のカウントデータから⼀列⽬（遺伝⼦ ID）を gene_ids.tsv（タブ 区切りファイル）というファイルに書き出す ⼆⾏⽬︓サンプル C1 のカウントデータを C1.tsv というファイルに書き出す 三⾏⽬︓サンプル C2 のカウントデータを C2.tsv というファイルに書き出す 四⾏⽬︓サンプル C3 のカウントデータを C3.tsv というファイルに書き出す コマンドでの実⾏に こだわりちらかす必要は ⼀⾏⽬︓gene_ids.tsv と各サンプルのカウントデータを結合して count.tsv に書き出す ありません していけば良いですね ubuntu@ubuntu-man$ paste gene_ids.tsv C1.tsv C2.tsv C3.tsv > count.tsv ubuntu@ubuntu-man$ vi count_data.tsv ubuntu@ubuntu-man$ cat count.tsv >> count_data.tsv ⼆⾏⽬︓サンプル名のファイルを作成する（上記の作業では各列のサンプル名が分からなくなるため） 三⾏⽬︓count.tsv を count_data.tsv に追記して解析⽤のデータセットを作成する